死的细胞如何才能复活？
死细胞的主要表现为蛋白质的凝固和遗传物质的复制停止，酶的活性也大大降低，我认为其中最主要的是遗传物质的复制停止只要让遗传物质的活性持久下去也许就会实现死细胞的复活，因为遗传物质直接影响蛋白质的合成（也就是说影响细胞的各项生理机能且大部分的酶为蛋白质）所以也影响着各种生物催化剂的合成，简单的说，要想死细胞复活只要将失效遗传物质活化，且加入合成蛋白质所需的各种嘌呤，嘧啶和部分糖，脂类，和必须氨基酸，血清等适合动物细胞生存的营养环境，还有适宜的pH，温度等外界条件应该死细胞可以复活。（因为学习有限，具体怎样激活遗传物质使其再具活性须请教高等学历的生物学家或教授等！）
还有电击的方法可以使细胞复苏，因为人本身就会产生电流来控制神经在外界的***下很有可能使细胞内再具有生存的能量，也许可以复苏，就像人们平时说的“炸尸”其实就是人死后在太平间等地接触电流后世部分细胞复苏而产生的现象，但这种现象持续时间不会太长，不能达到细胞的长时间复苏。
细胞复苏的步骤
真核细胞通常悬浮在带有血清和冷冻剂的培养基内，保存在-196°C 的液氮中。如果是商业订购的，通常储存在用干冰包裹的冻存管中。所以冻存后的细胞必须快速解冻后立即培养，以获得***的生存能力，为了除去冻存时的添加剂， 24 小时后要更换培养基。
一、材料
培养基， 37’C 预热
培养瓶
装有70 ％乙醇的烧杯
1ml 、10ml 的移液管、移液器及移液头
二、步骤
把冻存细胞的管子在37’C 的水浴融化，快速摇动， 1分钟内使管内的细胞融化。
把融化的管子浸入装有70 ％乙醇的烧杯内，整个实验在超净台内进行。
小心打开冻存管，不要让乙醇浸入管内。
将冻存管内的细胞转移到培养瓶中，并立即加入预热的培养基。
盖好培养瓶的盖子，培养24 小时。
用新培养基替换老培养基。
继续培养2~3 天或按说明书上的建议进行操作。
三、温馨提示
1.融解的细胞必须马上培养，如果来不及培养，就保存在液氮中。
2.细胞通常冻存为1 ml 的体积，加入新的培养基至10ml 。
3.可以在融化了冻存细胞后，把细胞离心下来，并用新鲜的培养基重新悬浮细胞，这种做法只适用于那些对冻存剂敏感的细胞，或者笫二天因为有事不能更换新培养基的情况。
细胞复苏步骤和注意事项
博凌科为解答：【材料】
1.常规细胞培养仪器设备
恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。
3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。
7.记录复苏日期。【注意事项】
1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作
较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）***选择进口产品。
3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除
DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，
死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液
体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。
5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响
细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是
10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
细胞复苏是什么意思？
平时研究用的细胞，有需要冷冻保存的。冷冻的过程称为冻存。和冻存对应的过程，称为复苏，通俗地说就是把冻上的细胞化开……不过也很有讲究，“慢冻速融”。我就定性地一说……你就定性地一听……
细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol
复苏
细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。
步骤：
1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃
在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。
如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。
2、 解冻细胞。
做法有 2 种选择：
(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。
如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/超净工作台。
(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。
3、 接种细胞：
此时做法有 3 种选择：
(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。
(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。
细胞换液
细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。
步骤：
1、 准备工作：
预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。
如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。
如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。
不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。
细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。
对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是***的，此时适合进行传代。
预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。
吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。
一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。
用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。
强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。
细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。
当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。
加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。
EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。
TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。
***控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。
吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。
在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。
将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。
通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。
对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。
细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。
对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是***的，此时适合进行冻存。
预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。
准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。
按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。
将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。
如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。
如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：
优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。
DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。
对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。
自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。
在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。
冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。
有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当***次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。
使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。
使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。
-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。
程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。
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